Halitoza – etiologia, diagnostyka oraz metody postępowania profilaktyczno-leczniczego

Halitoza – etiologia, diagnostyka oraz metody postępowania profilaktyczno-leczniczego

dr n. med. Agata Dudzik - specjalista periodontolog.

 

Szacuje się, że z powodu halitozy, czyli nieprzyjemnego zapachu z jamy ustnej, cierpi nawet 50% ludzi na świecie. W piśmiennictwie opisywanych jest kilka synonimów halitozy: bad breath, fetor ex ore, fetor oris, oral malodor. [1, 2]

Ludzkość zmaga się z halitozą już od tysięcy lat. Problem ten jest wspomniany w Biblii, zapiskach staroegipskich, rzymskich, greckich, azjatyckich i islamskich. Dawniej nieświeży oddech kojarzono zazwyczaj z nieprawidłową higieną jamy ustnej. Leczenie, jakie proponowano opierało się na stosowaniu ziół i tym podobnych substancji, które należało spożyć lub po prostu żuć. Dzisiaj leczenie halitozy opiera się na zidentyfikowaniu jej przyczyn i działaniu ukierunkowanym na ich zlikwidowanie.

Istnieje szereg czynników, które mogą powodować występowanie objawów halitozy. Wśród nich rozróżniamy zmiany patologiczne w obrębie głowy (ok. 90%) i pozostałych części organizmu. Za nieprzyjemny zapach odpowiedzialne są związki chemiczne – głównie tzw. Lotne Związki Siarki (LZS), ale też inne, jak np. związki amonowe czy kwasy organiczne.[3, 4, 5]

Brakuje danych, które potwierdzałyby częstsze występowanie halitozy u którejś z płci, jednak piśmiennictwo opisuje, że to kobiety częściej zgłaszają występowanie tego problemu. Fakt ten może wynikać z tego, że bardziej dbają one o swoją higienę, wygląd zewnętrzny i to, jak są postrzegane przez otoczenie. [6]

Przyczyny halitozy

Halitoza fizjologiczna zwana też, jako „morning bad breath” (poranny nieświeży oddech) spowodowana jest przez zmniejszone wydzielanie śliny podczas spoczynku nocnego, zachodzące wtedy procesy rozkładania resztek jedzenia i złuszczonych komórek nabłonka jamy ustnej, występuje przed spożyciem pokarmu i porannymi zabiegami higienicznymi. Uważa się, że to objaw fizjologiczny.[1, 2, 7, 8]

W 90% przyczyną halitozy są zmiany patologiczne w obrębie głowy (jama ustna, zatoki, jama nosowa), a w pozostałych 10% podłoże jest ogólnoustrojowe (np.: infekcje układu oddechowego, rak płuc, rak krtani, gruźlica, choroby wątroby, nerek, przewodu pokarmowego, cukrzyca, trimetylaminuria, białaczki, przyjmowanie niektórych leków, niektóre pokarmy (czosnek, cebula, kapusta, rośliny strączkowe), a także używanie wyrobów tytoniowych.[1, 2, 9]

Wśród wewnątrzustnych przyczyn halitozy wyróżniamy: zapalenie przyzębia (Gram – ujemne bakterie produkują LZS), nalot na języku, choroby błony śluzowej jamy ustnej, nieleczone ubytki próchnicowe, nie zdejmowanie protez akrylowych na noc, zmiany o charakterze nowotworowym, periimplantitis. [1, 3, 7]

Za nieprzyjemny zapach odpowiedzialne są wonne lotne związki obecne w wydychanym powietrzu, a wśród nich najczęściej wymieniane są lotne związki siarki (LZS - siarkowodór, merkaptan metylu i siarczek dimetylu) produkowane przez bakterie. Liczne badania naukowe dowodzą, że największa liczba bakterii bytuje na stronie grzbietowej języka, w jego części tylnej, w obszarze poza brodawkami okolonymi. Autorzy zwracają przy tym uwagę, że w większym stopniu ważna jest obecność nalotu na języku i jego jakość, niż jego ilość. [1, 3, 8]

Podział halitozy

Wyróżnia się halitozę prawdziwą i rzekomą. Halitoza prawdziwa może mieć podłoże fizjologiczne lub patologiczne. Halitoza rzekoma może przybrać postać pseudohalitozy lub halitofobii.

W tabeli 1. przedstawiono typy i opis halitozy prawdziwej według Miyazaki i wsp. [9]

Tabela 1 Halitoza prawdziwa - według Miyazaki i wsp.

 

Typ halitozy Opis
Halitoza prawdziwa 1. Odczuwalny nieprzyjemny zapach z jamy ustnej, jednak na akceptowalnym poziomie
A. Halitoza fizjologiczna 1. Nieprzyjemny oddech powstaje w wyniku procesów zachodzących w jamie ustnej Brak specyficznej choroby i patologicznych stanów, które mogłyby powodować halitozę.
2. Lotne związki siarki powstają zazwyczaj na powierzchni języka, w jego tylnej części.
3. Należy wykluczyć przyczyny związane z pożywieniem (czosnek, cebula itp.)
B. Halitoza patologiczna  
(i) Dotycząca jamy ustnej 1. Halitoza spowodowana patologicznym stanem w obrębie jamy ustnej.
2. Zalicza się tutaj halitozę mającą swe źródło w nalocie na języku, powikłaną innymi stanami patologicznymi w jamie ustnej (choroby przyzębia, kserostomia).
(ii) Spoza jamy ustnej 1. Halitoza spowodowana przez patologiczne stany zatok obocznych nosa, migdałków, gardła.
2. Halitoza spowodowana przez patologiczne stany dróg oddechowych, bądź górnych odcinków przewodu pokarmowego.
3. Halitoza spowodowana przez patologiczne stany innych części ciała, gdzie lotne związki są emitowane przez płuca (choroby wątroby, nerek, cukrzyca, krwotoki wewnętrzne.

Warto nadmienić, że pacjenci, cierpiący zarówno na halitozę fizjologiczną jak i patologiczną, mogą zgłaszać zaburzenia czucia smaku.

Halitoza rzekoma

Paradoks halitozy (ang. bad breath paradox) polega na tym, że pacjenci sami nie potrafią prawidłowo ocenić, czy halitoza u nich występuje, czy nie. Z tym zjawiskiem wiążą się pojęcia pseudohalitozy i halitofobii. W tabeli 2 pokazano typy i opis halitozy rzekomej według Miyazaki i wsp. (57)

 

Tabela 2 Halitoza rzekoma - według Miyazaki i wsp. (57)

 

Typ halitozy Opis
Halitoza prawdziwa  
A. Pseudohalitoza 1. Nieprzyjemny zapach z jamy ustnej nie jest wyczuwalny przez otoczenie, jednak pacjent skarży się na jego istnienie.
2. Stan pacjenta poprawia się po konsultacji z lekarzem, poprawie higieny jamy ustnej.
B. Halitofobia 1. Po przeprowadzeniu leczenia prawdziwej halitozy i pseudohalitozy, pacjent dalej wierzy, że występują u niego objawy halitozy.
2. Nie istnieją dowody (np. wyniki pomiarów lotnych związków siarki) sugerujące występowanie halitozy, nieprzyjemny zapach z jamy ustnej nie jest wyczuwalny przez otoczenie.

Pod pojęciem psuedohalitozy kryje się sytuacja kiedy pacjent wierzy, że zapach jego oddechu jest nieprzyjemny, jednak  nie da się tego potwierdzić obiektywnymi  metodami. Halitofobia to nieracjonalny strach. Dotyczy 0,5% dorosłej populacji.  Pacjenci, u których występuje halitofobia potrzebują wsparcia psychologicznego, ponieważ nie przyjmują do wiadomości obiektywnych wyników badań i zapewnień, że nie występuje u nich nieświeży oddech. [8, 9]

Co ciekawe, już w pierwszej książce poświęconej halitozie („The Breath and the Diseases which give it a fetid odor with directions for treatment” Josepha W. Howe, 1874r.) autor zwraca uwagę na fakt, że halitoza jest źródłem złego samopoczucia pacjentów i może prowadzić nawet do wykluczenia społecznego. Pamiętać należy więc, że osoby o niskiej samoocenie, przekonane, że ich oddech brzydko pachnie, unikają kontaktów z innymi, cierpią na tym ich relacje interpersonalne, a nawet życie zawodowe.

Badania pokazują różny odsetek pacjentów z pseudohalitozą. Niektórzy podają, że aż 20% pacjentów cierpi z powodu pseudohalitozy bądź halitofobii. W piśmiennictwie można znaleźć informacje o tym, że pseudohalitoza czy halitofobia występuje częściej u kobiet niż u mężczyzn. Pseudohalitoza często jest źle diagnozowana, co prowadzi do nieprawidłowego leczenia pacjenta (przeprowadzania dodatkowych badań, wprowadzania niepotrzebnych procedur medycznych - np. tonsillektomii itp.). [2, 4, 10, 11]

 

Jak zdiagnozować halitozę?

Po pierwsze, jak w każdej innej sytuacji, należy przeprowadzić badanie podmiotowe. Wywiad powinien dostarczyć informacji na temat.: przejmowanych leków, palenia wyrobów tytoniowych oraz papierosów elektronicznych, diety, zwyczajów higienicznych a także tego czy inne osoby z otoczenia pacjenta stwierdziły występowanie nieświeżego oddechu u danego pacjenta. Powinniśmy zapytać o częstotliwość, pory dnia, czas trwania objawów. Halitozę można zbadać metodami obiektywnymi i subiektywnymi. Do metod obiektywnych zalicza się badanie organoleptyczne i badania przeprowadzane przy użyciu specjalnej aparatury. Metody subiektywne to ocena własnego oddechu przez pacjenta. 

 Obiektywne metody oceny halitozy to: ocena organoleptyczna przeprowadzana przez lekarza, testy powietrza z jamy ustnej wykonane przy pomocy specjalnych aparatów, testy laboratoryjne, test BANA, inne testy, ocena nalotu na języku.

Przed wizytą pacjent nie powinien nic jeść i pić, używać produktów do higieny jamy ustnej i palić papierosów. Lekarz nie powinien w dniu badania pić kawy, mocnej herbaty, soków, palić tytoniu i stosować perfum. [2, 4, 8]

Metoda organoleptyczna jest uznana za złoty standard, jednak powinna być stosowana przez przeszkolonych w tym celu lekarzy. Skala oceny zawiera się w przedziale 0-5 (skala Rosenberga), gdzie 0 to brak nieprzyjemnego zapachu z jamy ustnej, a 5 to bardzo silny, nieprzyjemny zapach. Należy dodać, że badanie to może sprawić, że pacjent nie będzie się czuł komfortowo. Urządzeniami wykorzystywanymi do diagnostyki ilości LZS w wydychanym powietrzu są: OralChroma™ (Abilit Corporation, Kanagawa, Japan) i Halimeter® (Interscan Co., Chatsworth, CA, USA). Próbkę powietrza (1 cm3) z jamy ustnej pobiera się po 2 minutach od czasu zamknięcia ust przez pacjenta. Testy laboratoryjne wykorzystywane w diagnostyce halitozy to np. testy wykrywające bakterie odpowiedzialne za nieświeży oddech (PCR, wymaz z błony śluzowej jamy ustnej). Test BANA pozwala wykryć Gram-ujemne bakterie beztlenowe obecne na grzbietowej powierzchni języka, które mogą być odpowiedzialne za produkcję LZS. Inne testy używane w diagnostyce halitozy to np. Halitox™. Nalot na języku ocenia się dwiema metodami: jedną przeprowadzoną przez lekarza (ocena ilości nalotu na języku) oraz drugą polegającą na pobraniu próbki nalotu z określonego obszaru na języku (1 cm2) i następnie przeprowadzenie analizy ilości komórek zawartej w próbce. Należy zaznaczyć, że piśmiennictwo podaje, że poziom LZS w wydychanym powietrzu zależy w większym stopniu od obecności specyficznych gatunków bakterii niż od widocznego nalotu na języku, który może być zarówno ubogi, jak i bogaty ilościowo w bakterie. Miyazaki ocenia ilość nalotu na języku w zależności od tego, jaka część jego powierzchni grzbietowej jest zajęta. Dzieli on język na 4 kwadranty i ocenia ilość nalotu (0 – brak nalotu, 1 – mniej niż jedna trzecia, 2 – mniej niż dwie trzecie, 3 – więcej niż dwie trzecie powierzchni) (30). Gross do opisu nalotu na języku używa skali od 0 do 3 (0 to brak nalotu, 3 – bardzo duża ilość nalotu. Bosy używa skali opisowej (nalot duży, średni, mały, brak nalotu). Winkel natomiast dzieli powierzchnię grzbietową języka na sześć części (trzy z przodu i trzy z tyłu), a następnie ocenia ilość nalotu w każdym z sekstantów (0 – brak nalotu, 1 – mały nalot, 2 – duży nalot) i jego zabarwienie (0 – brak przebarwień, 1 – lekkie przebarwienie, 2 – duże przebarwienie).

Subiektywne metody oceny intensywności zapachu z jamy ustnej to wąchanie uprzednio polizanego przez siebie nadgarstka, wąchanie powietrza zebranego w papierowej torbie, do której pacjent wydychał powietrze przez określony czas, czy wąchanie zeskrobin z tylnej, grzbietowej powierzchni języka zebranych łyżeczką. Warto dodać, że pacjenci zazwyczaj nieprawidłowo oceniają jakość swojego oddechu. Zawsze jednak należy brać pod uwagę informacje uzyskane od pacjenta. Oprócz pytania o subiektywną ocenę oddechu, należy zapytać, czy osoby postronne zwracały w przeszłości uwagę, na fakt, że jego oddech jest nieświeży. 

 

Leczenie:

Mimo, iż halitoza dotyczy dużej liczby osób, niewielu naukowców zajmuje się badaniem nieprzyjemnego zapachu z jamy ustnej, a na świecie istnieje tylko kilka specjalistycznych ośrodków profesjonalnie zajmujących się jego diagnostyką i leczeniem.

Aby prawidłowo leczyć objawy halitozy należy zidentyfikować jej przyczynę. Jeśli podejrzewamy, że problem spowodowany jest w innym miejscu niż jama ustna pacjent powinien zostać skonsultowany przez odpowiedniego specjalistę (np. gastrolog, nefrolog). [14, 15]

Pierwszym krokiem, jaki należy podjąć to przeprowadzenie sanacji jamy ustnej . Pacjentom można też zalecić unikanie spożywania niektórych pokarmów (czosnku, cebuli, alkoholu, kawy itd.) czy palenia wyrobów tytoniowych. Kluczowe jest wdrożenie odpowiedniej higieny, w tym czyszczenie języka. Stosowanie czyścików do języka może zredukować, aż o 75% ilość LZS (Lotne związki siarki)  w wydychanym powietrzu. Co ciekawe, samo stosowanie czyścika do języka nie zmniejsza ilości bakterii, ale substratów, których używają one do produkcji LZS. Czyścik powinien być stosowany codziennie, a wymieniany co 2-3 miesiące. [14, 16, 17, 18]

Należy pamiętać, że w jamie ustnej bytuje kilkaset gatunków bakterii, które produkują różnorodne substancje podczas degradacji białek, co może skutkować powstawaniem nieprzyjemnego zapachu z ust.  Dostępne są na rynku produkty, takie jak miętówki, pasty do zębów, płukanki, spray’e i gumy do żucia, które pomagają kontrolować jakość oddechu. Jednak nie wszystkie z tu wymienionych produktów zwalczają przyczyny, a jedynie maskują objawy halitozy. Miętówki i gumy do żucia o świeżym zapachu mięty, eukaliptusa, mentolu itp. niezawierające aktywnych składników nie mają po 3 godzinach potwierdzonego wpływu na ilość bakterii na języku. Gumy jednorazowo powinny być używane przez maksymalnie 5 minut ze względu na możliwość wystąpienia komplikacji ze strony stawu skroniowo-żuchwowego. [12, 13, 14, 19]

Udowodniono, że samo szczotkowanie zębów i używanie czyścika do języka nie pozwala na efektywne usunięcie bakterii produkujących LZS ze wszystkich miejsc ich występowania. Dlatego celowe wydaje się wprowadzenie do rutyny stosowanie płukanek. Udowodniono, że związki w nich zawarte nie tylko maskują nieprzyjemne zapachy, ale także redukują ilość bakterii odpowiedzialnych za powstawanie lotnych, nieprzyjemnie pachnących substancji. Przeciętnie płyny do płukania jamy ustnej stosuje się dwa razy dziennie, po około 10 ml, przez 30-60 sekund. [15, 18, 19, 20]

 Płukanki te mogą zawierać triklosan, delmopinol, związki cynku, chlorheksydynę, olejki eteryczne, związki fluoru, oktenidynę, które działają na bakterie produkujące LZS. Za złoty standard płukanek mających na celu kontrolę płytki nazębnej, redukcję stanów zapalnych dziąseł i działanie antybakteryjne uznaje się te z zawartością chlorheksydyny (CHX) w stężeniu 0,12-0,2% . Chlorheksydyna uszkadza błonę komórkową bakterii i wpływa na redukcję ilości LZS w wydychanym powietrzu, jednak, jak wiadomo takiej płukanki nie można używać przez długi czas ze względu na powstawanie nalotu na powierzchni zębów i języka, a także zaburzenia w odczuciu smaków. Związki cynku w stężeniu przynajmniej 1% hamują działanie proteaz bakteryjnych, a także wiążą LZS. Cetylpirydyna redukuje liczbę bakterii produkujących LZS bytujących na języku. Triklosan działa antybakteryjnie. Do skutków ubocznych stosowania płukanek zalicza się, oprócz przebarwienia zębów i tkanek miękkich, uczucie metalicznego smaku, pieczenie i podrażnienie błony śluzowej jamy ustnej, reakcje alergiczne i zmiany na błonie śluzowej jamy ustnej. [7, 19, 20, 21]

Nowymi kierunkami badań nad metodami zwalczania halitozy jest stosowanie terapii, fotodynamicznej, laserów, krążków nasączonych różnymi substancjami, czy szczepionek.

Jeśli na podstawie wywiadu i badań dodatkowych stwierdza się, że przyczyny halitozy leżą poza jamą ustną, należy skierować pacjenta do dalszego leczenia specjalistycznego.

Leczenie pseudohalitozy i halitofobii polega na rozmowie z pacjentem, przekonaniu go, iż u niego obiektywne objawy halitozy nie występują. Pacjentom takim przedstawia się obiektywne wyniki badań oraz udziela się instruktażu higieny. Jeśli mimo to pacjent dalej jest przekonany o nieprawidłowości diagnozy i istnieniu halitozy należy skierować go na leczenie psychologiczne bądź psychiatryczne.

 

Podsumowanie

Istnienie halitozy zauważono na całym świecie już tysiące lat temu. Z biegiem czasu metody diagnostyki i leczenia zostały udoskonalone. Należy pamiętać, że występowanie halitozy jest dla pacjenta krępujące i uciążliwe i jeśli zgłasza on występowanie tego problemu, należy mu profesjonalnie pomóc, a najczęściej leczenie opiera się na wyleczeniu stanów patologicznych w obrębie jamy ustnej i zastosowaniu odpowiednich metod higienicznych. 

 

Bibliografia

1. Kapoor U, Sharma G, Juneja M, Nagpal A. Halitosis: Current concepts on etiology, diagnosis and management. Eur J Dent 2016;10:292-300. DOI: 10.4103/1305-7456.178294.

2. Wu, J., Cannon, R. D., Ji, P., Farella, M., & Mei, L. (2019). Halitosis: prevalence, risk factors, sources, measurement, and treatment ‐ a review of the literature. Australian Dental Journal. doi:10.1111/adj.12725.

3. Marcelo Faveri, Mitsue F. Hayacibara, Giselle Cancine Pupio , Jaime A. Cury , Claudia Ota Tsuzuki and Roberto M. Hayacibara: A cross-over study on the effect of various therapeutic approaches to morning breath odour; J Clin Periodontol2006; 33: 555–560 doi: 10.1111/j.1600-051X.2006.00955.x.

4. Bicak DA. A Current Approach to Halitosis and Oral Malodor- A Mini Review. Open Dent J. 2018;12:322-330. Published 2018 Apr 30. doi:10.2174/1874210601812010322.

5. Seerangaiyan K, Jüch F, Winkel EG. Tongue coating: its characteristics and role in intra-oral halitosis and general health-a review. J Breath Res. 2018 Mar 6;12(3):034001. doi: 10.1088/1752-7163/aaa3a1. PMID: 29269592.

6. Sabina Herman , Grazyna Lisowska , Joanna Herman , Ewa Wojtyna , Maciej Misiołek: Genuine halitosis in patients with dental and laryngological etiologies of mouth odor: severity and role of oral hygiene behaviors. Eur J Oral Sci 2018; 1–9 DOI: 10.1111/eos.12404.

7. Sharma K, Acharya S, Verma E, Singhal D, Singla N. Efficacy of chlorhexidine, hydrogen peroxide and tulsi extract mouthwash in reducing halitosis using spectrophotometric analysis: A randomized controlled trial. J Clin Exp Dent. 2019;11(5):e457-e463. Published 2019 May 1. doi:10.4317/jced.55523.

8. Miyazaki H, Sakao S, Katoh Y, Takehara T. Correlation between volatile sulphur compounds and certain oral health measurements in the general population. J Periodontol. 1995;66(8):679-684. doi:10.1902/jop.1995.66.8.679.

9. Renvert S, Noack MJ, Lequart C, Roldán S, Laine ML. The Underestimated Problem of Intra-Oral Halitosis in Dental Practice: An Expert Consensus Review. Clin Cosmet Investig Dent. 2020 Jul 3;12:251-262. doi: 10.2147/CCIDE.S253765. PMID: 32753975; PMCID: PMC7342603. J. Clin. Med. 2021, 10, x FOR PEER REVIEW 11 of 13

10. Aimetti M, Perotto S, Castiglione A, Ercoli E, Romano F. Prevalence estimation of halitosis and its association with oral health-related parameters in an adult population of a city in North Italy. J Clin Periodontol 2015; 42: 1105– 1114.

11. Bornstein MM, Stocker BL, Seemann R, Burgin WB, Lussi A. Prevalence of halitosis in young male adults: a study in Swiss army recruits comparing self-reported and clinical data. J Periodontol 2009; 80: 24– 30.

12. Allaker RP, Waite RD, Hickling J, et al. Topographic distribution of bacteria associated with oral malodour on the tongue. Arch Oral Biol 2008; 53: 8– 12.

13. Nakano Y, Yoshimura M, Koga T. Correlation between oral malodour and periodontal bacteria. Microbes Infect 2002; 4: 679–683.

14. Loesche WJ, Kazor C. Microbiology and treatment of halitosis. Periodontology 2000; 28: 256– 279.

15.  Deutscher H, Derman S, Barbe AG, Seemann R, Noack MJ. The effect of professional tooth cleaning or non-surgical periodontal therapy on oral halitosis in patients with periodontal diseases. A systematic review. Int J Dent Hyg. 2018 Feb;16(1):36-47. doi: 10.1111/idh.12306. Epub 2017 Aug 24. PMID: 28836329.

16. Silva, M. F., Cademartori, M. G., Leite, F. R. M., López, R., Demarco, F. F., & Nascimento, G. G. (2017). Is periodontitis associated with halitosis? A systematic review and meta-regression analysis. Journal of Clinical Periodontology, 44(10), 1003–1009.

17.  Setia S, Pannu P, Gambhir R, Galhotra V, Ahluwalia P, Sofat A. Correlation of oral hygiene practices, smoking and oral health conditions with self-perceived halitosis amongst undergraduate dental students. J Nat Sci Biol Med 2014; 5: 67– 75.

18. Armstrong B, Michelle L, Stoltenberg JL. Halitosis: a review of current literature. J Dent Hyg 2010; 84: 65– 75.

19. Winkel EG, Roldán S, Van Winkelhoff AJ, Herrera D, Sanz M. Clinical effects of a new mouthrinse containing chlorhexidine, cetylpyridinium chloride and zinc-lactate on oral halitosis. A dual-center, double-blind placebo-controlled study. J Clin Periodontol. 2003 Apr;30(4):300-6. doi: 10.1034/j.1600-051x.2003.00342.x. PMID: 12694427.

20. Erovic Ademovski S, Mårtensson C, Persson GR, Renvert S. The long-term effect of a zinc acetate and chlorhexidine diacetate containing mouth rinse on intra-oral halitosis-A randomized clinical trial. J Clin Periodontol. 2017 Oct;44(10):1010-1019. doi: 10.1111/jcpe.12779. Epub 2017 Aug 30. PMID: 28727160.

21. Aung EE, Ueno M, Zaitsu T, Furukawa S, Kawaguchi Y. Effectiveness of three oral hygiene regimens on oral malodor reduction: a randomized clinical trial. Trials. 2015 Jan 27;16:31. doi: 10.1186/s13063-015-0549-9. PMID: 25622725; PMCID:PMC4324034.